RNA病毒，例如導致COVID-19的冠狀病毒，在感染細胞的那一刻就處于生死競賽中。

這些病毒只有幾分鐘的時間在宿主細胞內建立它們的復制機制，然后其脆弱的RNA基因組中包含的遺傳指令 - 比DNA更脆弱 - 將被細胞內務管理破壞。如果成功，病毒可以在不到12小時的時間內從其RNA基因組的幾個拷貝變成新感染性顆粒中的五十萬個拷貝。否則，病毒就會死亡。

在1月24日由美國國家科學院院刊(PNAS)在線發(fā)表的研究中，Morgridge研究所的科學家們對病毒感染及其控制的這些關鍵早期階段提出了新的見解。研究人員開發(fā)了從細胞中釋放病毒RNA復制復合物的新方法，并通過冷凍電子顯微鏡(cryo-EM)以復雜的方式可視化它們。

冷凍電鏡將高度先進的成像與廣泛的計算分析相結合，使科學家能夠以分子到原子分辨率可視化天然狀態(tài)下的閃速冷凍分子，從而對生物結構提供革命性的見解，這為開發(fā)阻止疾病的療法奠定了堅實的基礎。

該研究小組由該研究所約翰和珍妮·羅病毒學中心主任、威斯康星大學麥迪遜分校分子病毒學和腫瘤學教授Paul Ahlquist領導。該團隊包括科學家Hong Zhan，Nuruddin Unchwaniwala和Johan den Boon，Morgridge研究員和威斯康星大學麥迪遜分校生物化學助理教授Tim Grant，以及合著者Andrea Rebolledo-Viveros，Janice Pennington，Mark Horswill，Roma Broadberry和Jonathan Myers。

大多數微生物和宿主基因在作為分子機器運行的大型蛋白質復合物中起作用。然而，這些關鍵組件的結構在很大程度上是未知的，這極大地限制了對相關過程的理解和控制。2017年，Ahlquist實驗室使用先進的模型病毒，首次對病毒RNA復制復合物及其引人注目的組織進行了全面成像。

他們發(fā)現親本病毒基因組RNA“染色體”緊密地盤繞在保護膜囊泡內，他們發(fā)現其通往細胞質的頸部通道是實際病毒RNA復制機制的所在地 - 基因組復制的動態(tài)，多功能引擎 - 在一個以前未知的，12倍對稱的環(huán)形復合體中，他們稱之為“皇冠”。

現在，在PNAS的新論文中，該團隊通過揭示這種分子冠及其組分酶域在原子到近原子分辨率下的復雜結構，提出了進一步的飛躍。這些分辨率明顯更高的結果顯示了這種復制引擎的許多不同功能模塊是如何排列的，為制定其組裝、動態(tài)操作以及干擾兩者的方法提供了重要基礎。

為了進行比較，第一作者Hong Zhan說：“我們實驗室在2017年對皇冠機械的首次可視化就像識別建筑物的存在和總體輪廓一樣。新的 2023 年分辨率就像展示了精細的細節(jié)，例如電線和門鎖。

“在病毒學中，”Ahlquist說，“迄今為止人們關注的復合物主要是在細胞之間移動的感染性顆粒，這些顆粒相對容易純化和研究，因為它們會從細胞中釋放出來。

“然而，大多數病毒復制過程發(fā)生在細胞內的復雜環(huán)境中，”他補充道。“這是一個新的篇章，我們已經能夠深入細胞內部，非常詳細地捕捉和成像執(zhí)行病毒復制中心事件的更復雜的病毒機制。

團隊成員Johan den Boon指出，除其他結果外，他們發(fā)現“冠由一個巨大的病毒RNA復制蛋白的兩個堆疊的12-mer環(huán)組成，其多個結構域提供了合成病毒基因組RNA新拷貝所需的所有功能。然而，上環(huán)和下環(huán)中的蛋白質具有顯著不同的構象，它們的組成結構域相對于彼此處于不同的位置。

一個含義是，相同的蛋白質結構域在上環(huán)和下環(huán)中以不同的方式運作。其他多項功能強調，表冠不是一個靜態(tài)的結構，而是一個精密、活躍的機器，它通過一系列運動進行和循環(huán)，以執(zhí)行其連續(xù)的活動。基于這種結構和進一步的針對性實驗，Morgridge團隊正在闡明冠的功能和體操。

這些研究的另一個有價值的發(fā)現是，較低的12-mer環(huán)是在RNA復制的實際步驟之前形成的組裝前體。然后，這種“原冠”前體招募病毒基因組RNA模板和其他組分以啟動新RNA的合成，并作為組裝成熟雙環(huán)復制復合物的基礎。

越來越多的證據表明，冠不僅合成了病毒RNA基因組的新拷貝，而且還有助于將這些新基因組遞送到基因表達和新傳染性病毒顆粒組裝的下游過程中。因此，冠似乎為組織整個感染過程中的許多關鍵階段提供了主要功能。

“僅僅減慢RNA復制復合物的組裝和功能就足以殺死這些病毒，”Ahlquist說。“這些新結果為尋找新的方法提供了堅實的基礎。

Ahlquist和其他團隊成員稱贊威斯康星大學麥迪遜冷凍電鏡研究中心(CEMRC)及其領導對他們的進步至關重要。CEMRC正在使這項有價值的技術可供威斯康星大學麥迪遜校區(qū)的數十名科學家使用，并作為國家中心，遠遠超出。在生物化學教授Elizabeth Wright的帶領下，CEMRC在幾乎所有形式的冷凍電鏡成像中提供了先進的功能。

來自Morgridge小組和其他研究人員的新結果表明，這些研究揭示的原理在進化上是古老的，并且類似的冠狀復合物對于這一大類中大多數(如果不是全部)RNA病毒的復制至關重要。這包括COVID-19 SARS-CoV-2冠狀病毒和許多其他病原體。

因此，保守的基本原則可以作為開發(fā)更強大，廣譜抗病毒策略的基礎，這些策略不僅可以抑制一組病毒的感染，還可以抑制整組病毒的感染，Ahlquist說。

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